熒光定量PCR原理解析

  無論是對(duì)遺傳病（如地中海貧血和血友病）、傳染病（如肝炎和艾滋病）或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的zuixin進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。

  根據(jù)終得到的數(shù)據(jù)不同,定量PCR可以分為相對(duì)定量和定量?jī)煞N。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；

  定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來決定。

定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi)對(duì)照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對(duì)照，以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問題。

 1為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？

  我們都知道理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的髙低都有很大變化，難以控制。所以，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，后得到的DNA拷貝數(shù)也是*不一樣的，波動(dòng)很大。

  傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。

  對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測(cè)等，需要測(cè)定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過PCR擴(kuò)増以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真shiqing況。在這種情況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。

  2 為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？

  CT值的定義是PCR擴(kuò)增過程中,熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大,CT值卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR,可以看出DNA濃度越高,CT值越小。DNA濃度每增加1倍,CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。

  這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡(jiǎn)便,以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素,可以在方程上增加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。

  —般地，我們有Rn=RB+X0(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)等于背景信號(hào)強(qiáng)度(RB)加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度,RS)與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT時(shí)，則有RT=RB+X0(1+EX)CTRS。兩邊取對(duì)數(shù)，得log(RT-RB)=logXO+CTIog(1+Ex)+logRs。整理此式,CTIog(1+Ex)=-logXO+log(RT-RB)-logRs。

  所以對(duì)于每一個(gè)特定的PCR反應(yīng)來說，EX、RT、RB和RS都是常數(shù)，所以CT值與logX0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數(shù)（X0）的對(duì)數(shù)成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。

  如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR的效率（即Ex）為100%，從上式推算出定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的zuijia斜率和CT值的zuijia范圍。

  3 怎樣確定CT值？

  實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）。“基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。基線范圍的定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個(gè)循環(huán)之間。早于3個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)很弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大，不是真正的基線高度;而在CT值前3個(gè)循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開始增強(qiáng)，超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來處理。

   顯然,CT值取決于閾值，閾值取決于基線,基線取決于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量,CT值是一個(gè)*客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多;CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。

  4 熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化

  雖然大多數(shù)定量PCR儀都會(huì)自動(dòng)扣除本底,但是仍然需要注意熒光信號(hào)強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正,以便不同樣本之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。

  由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正,以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來實(shí)現(xiàn),一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號(hào)。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的,因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽性參比信號(hào)以后，即Rn=R/RROX，就可以在同樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種計(jì)算。

  ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖3）。

  歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底,就得到DRn:DRn=Rn,樣本-Rn,空白。DRn是后構(gòu)建PCR實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。

  無論定量還是相對(duì)定量，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后,還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/UL或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。

  這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿伞⒈纫话氵x用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的,受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法為:[DNA]樣本/[DNA]IPC,或者DCT=CT樣本-CTJPC。因?yàn)镃T值與起始DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反比關(guān)系，可以證明，這兩種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。

  為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因zuihao在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定,所以這種對(duì)照稱為陽性內(nèi)對(duì)照(InternalPositiveControl,IPC)o要進(jìn)行IPC歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測(cè)能力,zuihao是4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。

  5 污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)

  為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施有使用UNG酶(UracH-N-Glycosylase)和熱啟動(dòng)。UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活,95°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP,所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟,UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。

  普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施,在加入PCR試劑的過程中、正式PCR開始前就會(huì)完成少量PCR擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而jinpaiTaq酶經(jīng)過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒有活性;只有經(jīng)過95°C10min的熱啟動(dòng)以后，封閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就大限度地減少了雜訊的生成。

  6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽性對(duì)照

  定量實(shí)驗(yàn),誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到小。所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)6~8次,以滿足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。

  如果作定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的DNA樣本,可以自己制備，也可以購(gòu)買商品化的試劑盒。其PCR反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同反應(yīng)板上同時(shí)定量。

  陰性對(duì)照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染。陽性對(duì)照則用于檢驗(yàn)PCR試劑和實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問題。如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了IPC，則IPC既可以用來校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽性對(duì)照的作用。

  7 TaqMan探針技術(shù)原理

  TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的：3'—5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。

  在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3'—5'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖4）。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。TaqMan探針根據(jù)其:3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種:普通的TaqMan探針和TaqManM探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-FluorescentQuencher),本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團(tuán)(圖5),可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短,既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明TaqManMGB探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。